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dntp是什么(dntp是什么意思)

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发布时间：2019-02-08加入收藏来源：互联网点击：

和模版互补结合的引物在DNA聚合酶（通常是DNA聚合酶I的大片段Klenow或T7DNA聚合酶）作用下发生互补链的延伸反应，反应体系中的2’-3’-双脱氧链核苷三磷酸(ddNTP)与底物脱氧核苷三磷酸(dNTP)竞争结合与延伸互补链末端，造成延伸终止。由于产生一系列分别终止于A、G、T、C位置的不同大小的DNA末端，应用高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳可分辨仅相差一个核苷酸的20－500碱基的DNA片段，结合放射自显影技术，便可直接读出模板DNA的待测序列。

148．化学裂解法测序原理：

采用化学试剂处理末端放射标记的DNA单链片段，造成碱基非特异切割，由此产生一组具不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按分子大小分离和放射自显影，直接读出待测DNA的核苷酸顺序。

149．大片段DNA序列测定的策略：随机法、嵌套缺失法、引物延伸法。

150．核酸分子杂交：是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。

151．核酸分子杂交的原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变和复的变化，以及复过程中各分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测核酸序列和已知核酸序列。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针，探针通常用于进行核素或非核素标记。

152．DNA变：在物理或化学因素作用下，，可以导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中所有的共价键不受影响，称为DNA变。

153．导致DNA变的方法：热变、酸碱变、化学试剂变。

153. Tm值：双链DNA变一半所需要的温度称作DNA的溶解温度。

154．复：两条互补的单链DNA分子在变条件除去后能重新按碱基互补配对原则以氢键相连形成双链DNA分子，这一过程称为DNA复。

155．影响杂交的因素：

1．核酸分子的浓度和长度

2．温度

3．离子强度

4．杂交液中的甲酰胺

5．核酸分子的复杂

6．非特异杂交反应

156．FISH(荧光原位杂交)：是一种非放射原位杂交方法，用特殊荧光标记核酸探针，可在染色体、细胞和组织切片上进行DNA杂交，能够非常有效地检测细胞内是否存在特定的DNA或RNA序列。

157．Southern Blotting步骤：

1．待测核酸样品的制备。包括制备待测DNA和DNA的限制酶消化。

2．待测DNA样品的电泳分离。

3．凝胶中核酸的变。

4．Southern转膜。常用的转膜方法：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法。

5．探针的制备

6．Southern杂交。必须先进行预杂交。

7．杂交结果的检测。

158：预杂交：能够结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。

159．Southern Blotting：是指DNA与DNA的杂交，将电泳分离的待测DNA片段转印并结合与一定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。

160．Northern Blotting:是指将待测RNA样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固－液相杂交，检测RNA（主要是mRNA）的方法。

161．斑点印迹：将RNA或DNA变后直接点样于硝酸纤维素膜上或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定及定量研究，称为斑点印迹（Dot Blot）.

162. 原位杂交：核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。

163．原位杂交的步骤：

1．组织或细胞的固定

2．组织细胞杂交前的预处理。一般用去垢剂（Triton X－100、SDS）或蛋白酶消化。

3．探针的选择和标记

4．杂交

5．杂交结果检测

164．液相杂交：是指待测核酸分子与核酸探针都存在与杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子，常用的液相杂交有RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。

165．RNA酶保护分析法：是利用RnaseA和RnaseT1能专一降解单链RNA而双链RNA则受到保护的特点，用放射标记的RNA探针与待检mRNA进行液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体。此法用于mRNA定量、mRNA末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。RPA的基本程序：

1．制备待测RNA

2．RNA探针的标记

3．杂交

4．除去单链RNA

5．电泳分析

166．探针的种类：cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针

167．标记物：

（1）核素标记物：32P、35S等，以32P最常用。

（2）非核素标记物：半抗原、配体、荧光素、化学发光探针。

168．标记方法：缺口平移法、随机引物法、PCR法、末端标记法

169．探针的纯化方法：乙醇沉淀法、Sephadex G-50柱层析法、微柱离心法

170．缺口平移法原理：利用适当浓度的DNaseI在DNA双链上随即切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5’端和一个3’端，3’端即可作为引物，在DNA聚合酶I的5’-3’DNA聚合酶活催化下，以互补的DNA单链为模版，依次将dNTP结合到切口的3’端，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶I的5’-3’核酸外切酶活在切口处将旧链从5’逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。

171．随机引物法原理：随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物，它们的顺序是根据计算机分析了生物基因组DNA六核苷酸排列的多种可能而设计的。对于任意一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物都有一些核苷酸片段与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些随机引物与变后的DNA单链结合，然后以此结合的随机引物为引物，以变后的单链DNA为模版，在Klenow酶的催化下，以四种dNTP（其中一种为标记物标记的DNA探针）为底物，合成与探针互补的且带有标记物的DNA探针。

172．PCR的原理：

PCR是一种体外扩增DNA的技术，基本原理是：作为引物的一对寡核苷酸与模板DNA同源序列按照碱基互补配对原则形成局部双链，然后在Taq DNA聚合酶作用下引导新链DNA的合成，一般经25－30个变、退火、延伸的循环，可以获得特异PCR产物。PCR反应体系包括：耐热的Taq DNA聚合酶、化学合成的寡核苷酸引物、4种dNTP、合适的缓冲液体系、模板DNA。

173．引物设计的原则：

1．引物长度一般为15－30个核苷酸

2．两个引物之间不应该存在互补序列

3．引物本身不应存在互补序列

4．引物与非特异扩增区序列的同源不应超过70％，引物的3’端连续8个碱基在待扩增区外不应有互补序列

5．引物的5’端最多可以游离10几个碱基而不影响反应的进行

6．引物碱基组成应随机分布，应避免嘌呤或嘧啶的堆积，特别是引物的3’端不应有连续3个G和C。

7．引物的3’端一定要与模版配对。

174．PCR到达平台期所需PCR循环次数取决于：样品模版的拷贝数、PCR的扩增效率以及DNA聚合酶的种类和活，以及非特异产物的竞争。到达平台期前，一般要进行25次以上的循环。

175．PCR反应注意事项：

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