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lb培养基(跟JOVE学习蛋白纯化（一）-详细步骤-有图有真相)

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发布时间：2016-12-08加入收藏来源：互联网点击：

今天，我们跟随JOVE一起学习如何进行蛋白纯化

今天要纯化的目的蛋白为MOG，为了纯化这个蛋白，首先将目的蛋白构建到质粒上。并添加相应的tag。

His tag用于镍柱纯化，大家应该很熟悉，这里我们看看其他的几个tag

首先是thioredoxin---

硫氧还蛋白（thioredoxin）作为融合标签可以促进蛋白的可溶性表达。

TEV Protease是一种在大抽杆菌中重组表达的带His标签(6X His tag)的烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus, TEV)的半胱氨酸蛋白酶，能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser，并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切，常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase (GST)、His或者其它标签的蛋白酶。

建议把GST或His等标签设计在融合蛋白的N端，并在GST或His等标签与目的蛋白之间设计加入TEV Protease专一性识别与酶切的上述七肽序列。这样在GST或His标签被酶切后，在目的蛋白的N端仅有一个额外的Gly/Ser氨基酸残基，从而最大限度地减少了对目的蛋白结构和功能的影响。构建含有TEV Protease专一性识别位点的目的蛋白表达质粒。

第一步 蛋白的诱导表达

用BL21-MOGtag甘油菌种接种5mlLB培养基（0.1mg氨苄青霉素/ ml），并在37℃孵育过夜，200rpm。

将两个含有500ml无菌LB培养液的1L锥形瓶置于37℃培养箱中备用。

3.将500μl100mg / ml氨苄青霉素加入含有500mlLB的烧瓶中。将1ml来自步骤1.1的过夜培养物添加到两个LB培养瓶中。在37°C和200转/分的条件下孵育5小时，直到光学密度为0.6。

4.从一个烧瓶取一个1毫升等分试样，并将其转移到一个单独的1.5毫升离心管中。将细胞以16,000×g离心1分钟，

去除上清液。将管标记为T0（预诱导），然后将细菌沉淀物放入-20℃的冰箱中以备将来的十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析

5.将0.5ml的1M异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）加入到每个培养瓶中。孵化在37的烧瓶200转/分钟4小时，然后在室温75转/分钟过夜。

第二步 收集细菌

收获MOGtag，首先在Triton X-100缓冲液中裂解细菌，然后超声处理。然后从包涵体中释放MOGtag并用咪唑和胍变性，产生含有MOGtag蛋白的粗蛋白溶液。

从过夜培养物取一个1ml等分试样并将其转移到1.5ml微量离心管中。将细胞以16,000×g离心1分钟并除去上清液。将管子标记为TO / N（诱导后），然后将细菌沉淀放入-20°C冰箱以备将来进行SDSPAGE分析。

2.将培养物均匀分布在兼容高速离心的250ml瓶中，并从这点开始将其保存在冰上。将细菌细胞在4℃下以22,000×g离心15分钟。

3.丢弃上清液。将菌体储存在-20°C或继续步骤。

4.通过加入60μl Triton X-100制备裂解缓冲液（0.1mg / ml鸡蛋溶菌酶，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的0.1％Triton-X（v / v））和120μl50mg / ml鸡蛋溶菌酶储备溶液加入到60mL PBS中。

5.将步骤2.3的所有细菌沉淀物重新悬浮并合并在总共30ml的裂解缓冲液中。把这个体系调到50ml的高速离心管。将此管置于30°C水浴中30分钟。在孵化期间，摇动试管两次重悬细胞。

6.孵育后，将试管转移到冰上，并以20kHz，70％振幅，3秒脉冲，3秒脉冲和5秒每轮的脉冲。超声波共六轮，让解决方案之间的冰冷中回合。

7.将溶液在4℃以24,000×g离心15分钟。弃上清，重复步骤2.5-2.7一次。将颗粒储存在-20°C或继续步骤2.8。

8.通过加入0.8766g的NaCl，0.09456g的Tris-HCl和0.01021g的缓冲液A（500mM NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑，pH7.9 咪唑加入到100ml烧杯中。加水直至体积达到28ml，然后将溶液的pH调节至7.9。然后，转移到100毫升量筒，加水直到体积为30毫升。

9.在30ml缓冲液A中重悬步骤2.7的沉淀，并将该溶液在4℃下孵育3小时。在此期间，称量17.2克盐酸胍。

10.使用与步骤2.6中相同的设 置在冰上超声处理溶液。然后将17.2克盐酸胍加入到溶液中。在冰上孵化1小时以溶解MOGtag蛋白质。

11.将溶液在4℃以24,000×g离心30分钟。收集上清液并将上清液保存在4°C直到蛋白质纯化。

第三步 蛋白纯化

注意：在以下步骤中，MOGtag蛋白将通过4轮吸附到带电荷的镍树脂上（通过His标签）和洗脱进行纯化。

1.制作以下缓冲液：

1.准备缓冲液B（500mM NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑，6M盐酸胍，pH7.9）。加入5.844g NaCl，0.6304g Tris-HCl，0.0681克咪唑和114 64克盐酸胍加入到500毫升烧杯中。然后加水，直到达到190毫升，调节pH值至

7.9。将溶液转移到250毫升量筒中，加入水直到体积为200毫升。

2.准备洗脱缓冲液（500mM NaCl，20mM Tris-HCl，0.5M咪唑，6M盐酸胍，pH7.9）。加入5.844克NaCl，0.6304克Tris-HCl，6.808g咪唑和114.64g盐酸胍加入到500mL烧杯中。加入水，直到达到190毫升，调节pH值至7.9。将溶液转移到250毫升量筒中，加入水直到体积为200毫升。

3.准备带状缓冲液（500mM NaCl，20mM Tris-HCl，100mM EDTA，pH7.9）。加入5.844g NaCl，0.6304g Tris-HCl，40ml 500mM EDTA加入到500mL烧杯中。加水直到达到190毫升，调节pH值到7.9。转移到250毫升

加入水，直到容积达到200毫升。

4.准备电荷缓冲液（0.1M硫酸镍）。向500ml烧杯中加入5.257g硫酸镍，加水至190ml

（注意，在硫酸镍溶于水中之前，不要在通风橱外处理硫酸镍）。一旦硫酸镍溶解，将溶液转移到250毫升量筒中，加入水直到体积达到200毫升。

2.将10ml镍树脂分离到两个离心力超过4,500xg（每管5ml）的锥形50ml离心管之间。

3.charge和平衡镍树脂：

通过向每个含有树脂的管中加入40ml水来清洗树脂。水平放置在摇杆上，让他们搅拌5分钟在4°C。一旦完成，在4℃下以4,500×g离心8分钟 。

弃去上清液，以避免干扰颗粒。加入40毫升电荷缓冲液到每个管。将管子转移到一个摇杆，让他们在4°C搅拌15分钟。一旦完成，在4℃下以4,500×g离心8分钟。

3.弃去上清，然后加入40毫升缓冲液B到管中。将试管转移到摇杆上，让它们在4℃搅拌5分钟。

一旦完成，在4℃下以4,500×g离心管8分钟，然后丢弃上清液。

4.可选：取150μl步骤2.11中收集的溶解蛋白质，转移至1.5ml微量离心管中。标记管预孵育和冻结在-20°C为今后的SDS页面分析（图3，纯化前MOGtag）。

5.纯化MOGtag蛋白质：

将来自步骤2.11的全部溶解蛋白质（〜40ml，减去步骤3.4中移除的小样品）转移至第一管。将步骤3.3中的镍树脂混合，并在4℃的水平摇床上放置1小时。

2.在4℃下以4,500×g离心管8分钟。一旦完成，将上清液转移到第二管

镍树脂并按前述步骤进行孵育。同时，用管1继续下面的步骤3至6。

3.用40ml洗脱缓冲液重新悬浮试管1中的镍树脂，并将试管水平放置在4℃摇床上5分钟。然后，在4℃下以4,500×g离心管8分钟。

4.将含有洗脱的MOGtag蛋白质的上清液转移到250ml标记为“纯化的MOGtag蛋白质”的瓶子中，并将该瓶保持在4°C。在每个洗脱步骤中，将得到的上清液收集在该瓶中。

5.向镍树脂中加入40ml带状缓冲液，并在4℃下在水平摇床上放置5分钟。

6.在4℃下以4,500×g离心管8分钟。弃去上清液，然后按步骤3.3中所列的方法重新添加镍树脂。

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