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lb培养基(默克Sigma实验分享 - 用工程质粒转化大肠杆菌)

菌落,货号,琼脂lb培养基(默克Sigma实验分享 - 用工程质粒转化大肠杆菌)

发布时间：2020-12-06加入收藏来源：互联网点击：

向100μL感受态细胞中加入2-5 μL每种连接反应物（或对照反应物）。将混合物移出时，要用吸吸头非常快速地搅动。请勿上下移液。尖端可能处于室温，因此应尽快将其拿出来。

在冰上孵育至少15分钟。更长时间没问题，但我们只测试了最长至45分钟。

在加热块或水浴中在37 °C下热休克3分钟。

然后加入1 mL不含抗生素的LB培养基（货号L3522、L2542或L3022），并在37 °C下将细胞再孵育15分钟。

将含有转化后的感受态细胞的所有LB倒在含有正确抗生素的琼脂板上。

将板竖直放置于1级罩内或者37 °C培养箱中，盖子微启，晾干约5-10分钟。请勿在用于哺乳动物组织培养的罩子中执行这一操作。重新盖上盖子，当平板接近干燥时，将其翻过来。请勿让板干燥时间过长，否则有些细菌可能会随琼脂干燥而死亡，而你最终得到的是一张非常薄的琼脂片！

将平板在37 °C过夜孵育。即将出现的菌落来自单个转化细胞，并且由于存在质粒而对抗生素具有抗性。每个菌落将包含数同一个细胞的百万个相同拷贝，因此称为克隆。

这个步骤很简单，因此不需要单独出一份实验方案，但鉴于它是整个过程的一个重要部分，我们在这里简单描述一下。

在进行了有适当对照的转化之后，您应该有三个细菌板。如果一切都正确，您应该在连接板上有很多菌落，而在没有片段但有连接酶的板上有较少的菌落（或没有菌落），在没有片段和连接酶的板上菌落会更少（或没有菌落）。在对照板上背景通常相当高，这并不一定意味着连接没起作用，只要在连接板上有更多的菌落就行。挑选用于进一步筛选的菌落的个数，由对照板（在反应物中有连接酶）的菌落数与连接板上菌落数的比率决定。

例如，如果连接板上的菌落数比对照板多10倍，那么理论上（如果您正在进行标准的粘性末端定向克隆）您所挑选的10个菌落中有9个会将正确的片段连接到其中（由于多聚体或多联体等，这通常不会成为现实）。在这种情况下，挑选5-10个菌落应该绰绰有余。

如果与对照板相比，在连接板上只有两倍多的菌落，则最好挑选10个或更多菌落。可以将板放入冰箱中，如果需要可以挑选更多的菌落。在挑选菌落时不要过于冲动，挑选50只是浪费时间，除非您正在做一个非常困难的连接。

如果板之间没有差异，则说明反应失败。在这种情况下，不必再麻烦挑选菌落了。重复前面的步骤，尝试通过消化更长时间、去磷酸化更长时间、暴露于更少的紫外线、或尝试其他酶来减少背景。酶干脆无效是常事。

挑选菌落实验方案

将板从37 ºC培养箱中取出后，将它们倒扣（即它们在培养箱中的放置方向）在工作台面上。

使用移液器或类似仪器，将含有正确浓度抗生素的3-5 mL LB培养基（货号L3522、L2542或L3022）移液到无菌25 mL或50 mL试管中（试管数量取决于您想要培养的数量）或类似的带螺旋盖的管，并给它们贴上标签。细菌培养物与管中空气量的体积-体积比，对于确保细菌生长至足够密度是很重要的，类似说明书从来不会要求液体与空气之比低于1:3，但最好更高些。

一只手拿着无菌移液器吸头靠近移液器的一端，另一只手拿起倒扣着的含有连接步骤生成的细菌的板。用手将板翻过来让细菌面朝上朝向您，然后用移液器吸头尖轻轻接触完全与任何其他菌落分离的菌落。

现在将粘有细菌的同一个吸头放入含有LB培养基的试管（来自步骤2）中的一个中，并稍微移动一下吸头，以使一些细菌释放到液体中。有些人只是将移液器吸头弹射到培养基中，但如果这样做，第二天需要把它拿出来。

在摇床中，37 ℃、190-225 rpm孵育这些试管过夜。

注意：上述程序应使用无菌技术进行。理想情况下，靠近本生灯进行，如果没有，1级罩就足够了。实际上，与其担心外部细菌污染样品（因为它们的污染机会很少，除非它们来自您之前在工作台上进行的其他实验），可能更值得注意的是每个样品间不要有交叉污染，因为您在同一种抗生素中培养所有这些样品。

作为液体培养物生长的细菌菌落可以在4 °C下保存几周而不会变质。 任何已确认包含您的插入物的克隆，都应存储起来供长期使用。 最常用的克隆储存方法是冷冻甘油原液。对于室温下的替代品（特别适用于较大的样品数量），请考虑Biomatrica的CloneStable产品（货号93121-017）所使用的新技术。

甘油原液实验方案

将5 mL甘油（货号G5516）与5 mL蒸馏无菌水混合，制备50％甘油原液。 充分混合。

对于每个要存储的菌落，将500 μL过夜培养物与500 μL 50％甘油溶液混合。 充分混合，并分装到2 mL冷冻管中。

储存在-80 °C。




本文到此结束，希望对大家有所帮助呢。

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