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lb培养基(默克Sigma实验分享 - 用工程质粒转化大肠杆菌)

菌落,货号,琼脂lb培养基(默克Sigma实验分享 - 用工程质粒转化大肠杆菌)

发布时间：2020-12-06加入收藏来源：互联网点击：

制作感受态细胞（INOUE法）

Inoue及其同事在1990年开发了该方法。它非常适用于克隆中常用的许多菌株。起初的方法要求在18 °C下培养过夜的大肠杆菌培养物。我们发现如果它们在37 °C下过夜生长也能得到很好的效果。或者，您可以购买即用型的化学感受态细胞或电感受态细胞，包括BL21（货号CMC0014）和SIG10（货号CMC0001）。商购的现成感受态细胞具有优势，因为它们的制备已经过优化，为独特应用提供具有高转化效率的特化细胞。更多内容到默克sigma试剂官网查看：www.sigmaaldrich.cn


您将需要：

DMSO（二甲基亚砜）（货号D8418）
用于培养大肠杆菌的LB板 用于培养过夜培养物的3 × 250 mL（货号H8032） 用作起始培养物的额外SOB 震动培养箱 0.5 M PIPES (哌嗪-1,2-双[2-乙磺酸]) pH 6.7（货号P8203） Inoue转化缓冲液 无菌微量离心管 无菌离心管，容量至少250 mL 能够以2,500 × g的力旋转这种管的离心机

热休克感受态细胞生产实验方案

第1天

从已孵育过夜的LB板中挑选单个大肠杆菌菌落。在含有菌落的50 mL管中接种2 ml SOB培养基的起子培养物，并在37 ℃下震动孵育约7小时。

制备或解冻Inoue转化缓冲液的等分试样。

接种含有250mL SOB培养基和三种不同体积的起子培养物的三个烧瓶，以确保其中一个在第二天早晨达到所需的OD。我们建议尝试10 μL、50 μL和250 μL。将烧瓶在37 °C下震动孵育过夜。

第2天

第二天早上读取所有三种培养物的OD600。继续监测OD600。

当其中一种培养物的OD600达到0.55时，将该培养物转移到冰水浴中10分钟。 （开始冷却微量离心管。）

2,500 x g、4℃离心10分钟收获细胞。

倒掉上清液，将细胞转移到80 mL冰冷的Inoue转化缓冲液中轻轻重悬细胞。

2,500 x g、4℃离心10分钟回收细胞。

倒掉上清液，将细胞移液到10 mL冰冷的Inoue转化缓冲液中轻轻重悬细胞。

加入0.75 mL DMSO，旋转混合，将细胞在冰上静置10分钟。

将100 μL等分的细胞悬液分配到冰冷的微量离心管中。

将等分的感受态细胞分批放入液氮中快速冷冻。

将等分试样储存在-80 °C冰箱中直至需要。

该配方设计用于制备约50-60个Luria-Bertani（LB）琼脂板，用于用标准质粒培养大肠杆菌。或者，您可以购买预先测量的EZ-Mix™形式LB琼脂，货号L7533。

10 g胰蛋白胨（货号T2559)
5 g 酵母提取物（货号Y1625，Y1626） 10 g NaCl（货号S3014） 15 g琼脂粉（货号L2897） 用水定容至1升

量出上面的量，添加到带有良好工作盖的1升的瓶子（见下文）。加入干净的去离子水（理想情况下至少18兆欧）。拧紧盖子，摇动混合液体和粉末，不要希望完全溶解，但只要瓶底没有粉末，且液体里没有成团粉末就行。如果没有适当混合，瓶底粉末可能会被烤干。拧松盖子约半圈，缠上高温高压灭菌带，然后高温高压灭菌。

高温高压灭菌后，确保盖子完全拧紧，请勿冷却到45-50度以下。琼脂通常会在40度左右凝固。我们的经验是，如果拿起来不烫手，即可以倒出了，而且实际可能已经太凉了。当琼脂太热时，请勿添加抗生素，否则会影响抗生素的稳定性和半衰期，特别是氨苄西林。加入适量的抗生素（见下文），轻轻旋转混合。避免有气泡，因为这会导致培养板含有气泡或不均匀。每个板大约浇注12-15mL（货号Z617636）。一种简单的方法是将板子摞起来，大的截面（盖子）竖起来。拿着最底下那块板的盖子将摞在一起的所有板子提起来，用另一只手倒琼脂。倒入足够充满底部的量，然后再多倒一点。然后将这摞板放下，然后拿着这摞板的第二个盖子将这摞板子提起进行浇注。这样做看起来很不均匀，但随着时间推移，这其实非常可再现。

或者，您可以购买含有或不含抗生素的现成的LB琼脂板：

LB琼脂板（货号L5542）
含有氨苄霉素的LB琼脂板（货号L5667）
含有卡那霉素的LB琼脂板（货号L0543）
含有羧苄青霉素的LB琼脂板（货号L0418）
含有四环素的LB琼脂板（货号L8795）

提示1：许多实验室瓶子都有蓝色或透明的塑料突边，它们有可能缺失或被火烧焦。当浇注板时，这些蓝色突边防止琼脂从瓶壁流下，并在高温高压灭菌后保持气密。确保突边完好无损。

提示2：1升是相当多的琼脂和抗生素，可按您的需要缩小配方。我一般每次制作0.5升（约30个板）。

抗生素浓度：

在水中制备原液：每1 mL培养基添加1 µl 卡那霉素（货号K4000）— 原液50mg/mL，终浓度50 µg/mL
氨苄霉素（货号A9518）— 原液100mg/mL，终浓度100µg/mL 链霉素（货号S6501）— 原液50mg/mL，终浓度50µg/mL 奇霉素（货号S9007）— 原液100mg/mL，终浓度100µg/mL

在乙醇中制备原液：每ml培养基添加5 µl 氯霉素（货号C0378）— 原液34mg/mL，终浓度170µg/mL
四环素HCL（货号87128）— 原液10mg/mL，终浓度50µg/mL

将DNA导入细菌的最简单方法是热休克和电穿孔。热休克的原理正如其名，是用热使细菌休克。如果不能造成休克，则不起作用，因此之前必须保证细菌是冷的。这个要求怎么强调都不过分。当细菌从冷变热时，它的细胞膜上会形成孔，从而使DNA进入细胞。电穿孔的原理类似，但只是用电打孔。这些过程均是模仿或至少基于细菌的自然能力过程。通常，电穿孔产生更多的菌落，但并非总是如此。对于大多数DNA克隆应用，热休克都好用。

细菌转化热休克实验方案（常用方法）

每次在冰上进行DNA /连接反应或对照反应，都解冻一管预制的感受态细胞，并将管深深地推进冰里。解冻需要大约5-10分钟。保持细胞尽可能冷，避免手接触到管内装着细胞的那部分管身，即使少量的热量也会影响转化过程。

在冰上预冷15 mL Falcon管（货号SIAL0791），将3-4 μL连接反应物（或对照反应物）转移到每个管中。

在每个连接反应中加入95 μL感受态细胞，在冰上至少孵育20分钟。更长时间没问题，但我们只测试了最长至45分钟。

在加热块或水浴中在42 °C下热休克90秒。

然后加入1 mL不含抗生素的LB肉汤（货号L3022、L2542或L3522）或者SOC培养基（货号S1797），并将细胞在37 ℃、227RPM的培养摇床中孵育1小时。

将含有转化后的感受态细胞的所有LB倒在含有正确抗生素的琼脂板上。

将板竖直放置于1级罩内或者37 °C培养箱中，盖子微启，晾干约5-10分钟。请勿在用于哺乳动物组织培养的罩子中执行这一操作。请勿让板干燥时间过长，否则有些细菌可能会死亡。

将平板在37 °C过夜孵育。即将出现的菌落来自单个转化细胞，并且由于存在质粒而对抗生素具有抗性。每个菌落将包含数同一个细胞的百万个相同拷贝，因此称为克隆。

细菌转化热休克实验方案（其他方法）

每次在冰上进行DNA /连接反应或对照反应，都解冻一管预制的感受态细胞，并将管深深地推进冰里。不要只是把管放在冰上或冰中，而是使管尽可能地冷。解冻需要大约5-10分钟。避免手接触到管内装着细胞的那部分管身，即使少量的热量也会大大影响转化过程。

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