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蛋白质的分离纯化（细胞器内蛋白质的制备）

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发布时间：2020-12-06加入收藏来源：互联网点击：

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蛋白质的分离和纯化(在细胞器中制备蛋白质)

在生物体中，细胞的划分使得不同的细胞器有自己的蛋白质系统。细胞器是一种动态结构，如内质网、细胞核、高尔基体等。它的蛋白质除了蛋白质之外，还有蛋白质和蛋白质，瞬间相互作用。随着近年来分子生物学、分子遗传学、基因工程等学科的发展，对各种细胞器中所含的生物大分子，如核酸、蛋白质等的研究工作越来越多。从各种细胞器中分离各种特定的蛋白质已成为生物大分子制备的重要组成部分。掌握这些蛋白质的特异性有助于了解它们的具体功能，深入解释细胞器的功能，获得细胞器蛋白质的定位信息，有助于进一步了解亚细胞器的蛋白质组。

根据实验需要制备某种生物大分子时，通常是先破碎细胞，再分离细胞器，最后采用相应的方法获得所需的生物大分子成分。

1.细胞分裂

分离亚细胞组分的第一步是细胞破碎。实验中经常使用温和的破碎方法，可以使用显微镜监测来确保细胞器的结构完整性。最常见的方法是制备组织匀浆或细胞匀浆。匀浆是将组织或细胞放入含有等渗匀浆介质(即0。25摩尔/升蔗糖和0。003 mol/L氯化钙溶液)，以便将细胞机械研磨成各种亚细胞组分和内容物的混合物。

2.亚细胞成分的分离

亚细胞组分需要分阶段分离，主要是通过离心技术从低速到高速，使非均质混合物中的颗粒按大小和密度分批沉降到离心管的不同部位，然后分段收集，得到各种亚细胞组分。由于样品中不同大小和密度的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，每一级分离得到的第一次沉淀不一定是最重的纯颗粒，必须经过反复的悬浮和离心才能提纯。分离亚细胞组分的主要离心技术是差速离心和密度梯度离心。

(1)差速离心。

在密度均匀的介质中从低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中，细胞器沉降的顺序一般是：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、高尔基体和内质网，最后是核糖体。

由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且一些慢沉降的颗粒往往被快沉降的颗粒包裹在沉降块中，因此通常需要重复2-3次才能得到理想的结果。差速离心初步分离的细胞器往往需要密度梯度离心进一步分离纯化。

(2)密度梯度离心

某种介质用于在离心管中形成连续或不连续的密度梯度。将细胞的悬浮液或匀浆置于培养基的顶部，细胞分层并通过重力或离心力分离。

在实践中，通常使用差速离心和密度梯度离心，即通过一系列差速离心步骤和密度梯度离心将均质化产生的细胞裂解物与细胞器和其他颗粒分离。

3.亚细胞成分的分析和确认

分离亚细胞组分的第三步是分析和确认分离的组分。常用分析

方法包括形态和功能鉴定。

4.注意事项和建议

(1)在提取细胞器的过程中，需要针对不同的细胞器制定提取方案，保证其在提取过程中的完整性，并在提取结束时检查细胞器的完整性。

(2)细胞器提取过程中引入的试剂可能会影响后续的蛋白质提取等实验，在方案设计时应予以考虑。

(3)在提取蛋白质的过程中，要注意对蛋白质的保护。有些蛋白质很容易降解，所以可以加入蛋白酶抑制剂和还原剂，并且操作要严格

本文到此结束，希望对大家有所帮助呢。