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小鼠,肠道,物种rarefaction_abrogate

发布时间：2019-02-08加入收藏来源：互联网点击：

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张玉双, 于富洋, 吴忠冰, 王一然, 李晶. 食管鳞癌原位模型小鼠肠道菌群分析. 中国全科医学[J], 2022, 25(08): 945-951 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2021.01.501

ZHANGYushuang, YUFuyang, WUZhongbing, WANGYiran, LIJing. Analysis of Gut Flora in a Mouse Model of Esophageal Squamous Cell Carcinoma in Situ. Chinese General Practice[J], 2022, 25(08): 945-951 doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2021.01.501

最新的《全球癌症统计报告》数据显示，2020年全球食管癌新发病例数为60.4万例，亡病例数为54.4万例，分别占全球癌症新发、亡总病例数的3.1%、5.5%[1]。食管癌发病风险地域差异较大，我国是食管癌发病高风险国家，据统计2020年我国新发食管癌病例数为32.4万例，亡病例数为30.1万例，分别占全球食管癌新发、亡总病例数的53.7%、55.3%[2]。我国食管癌患者病理类型以鳞癌为主，早期行根治术后预后较好，但由于相当多的食管癌患者确诊时已处于中晚期，失去了手术机会，因此提高食管癌早期诊断率仍具有十分重要的意义。

随着高通量测序技术的应用与发展，肠道微生态研究已成为目前肿瘤领域研究的热点之一。有研究证实肠道菌群在肿瘤的发生、发展中具有重要作用，食管鳞癌患者口腔、癌组织及癌旁正常组织中菌群结构发生了改变并与食管癌的发生有关[3,4]。因肠道菌群的影响因素较多，本研究特选取饲养环境可控的食管鳞癌原位模型小鼠，以观察与食管鳞癌相关的肠道菌群结构变化、筛选出特异改变的肠道菌属，为食管鳞癌的早期筛查提供参考。

1　材料与方法1.1　实验动物

从北京维通利华实验动物技术有限公司购买雌SPF级C57BL/6小鼠20只〔合格证号：SCXK（京）2016-0006〕，体质量14~17 g，鼠龄6周。适应喂养1周后将所有小鼠随机分为对照组（DZ组）和模型组（MX组），每组10只。所有实验操作严格遵照河北医科大学实验动物中心指南执行，遵守动物保护、动物伦理原则及相关规定。本实验时间为2020年8月至2021年5月。

1.2　干预方法

DZ组小鼠常规喂养32周，全程给予普通饮用水；MX组小鼠按照造模方法常规喂养并给予含0.1 mg/ml的诱癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）饮用水喂养16周，之后给予普通饮用水喂养至32周。4NQO饮用水制备方法：将诱癌剂4NQO（购自Sigma-Aldrich公司，型号：N8141）溶解于1，2丙二醇，配制成浓度为2%的母液并保存于-20 ℃冰箱，使用时按照0.1 mg/ml浓度比例混入饮用水中。

1.3　粪便的无菌收集与处理

喂养32周后收集两组小鼠粪便：在笼具里面放入干净的滤纸后将小鼠依次放入，每笼1只；用镊子轻轻刺激小鼠下腹和肛门，待小鼠排便后立即用冻存管进行收集；将冻存管做好标记后放入液氮中，5 min后再将冻存管放入-80 ℃冰箱中保存。最终共收集到20个粪便标本，每组10个。上述操作均在灭菌超净台上进行，且所用材料均采用紫外线灭菌处理。

1.4　粪便样本检测与数据分析

采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB法）提取粪便标本基因组DNA，应用16SV34区域引物序列341F：CCTAYGGGRBGCASCAG、806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT进行聚合酶链式反应（PCR）扩增；将PCR产物进行磁珠纯化，并根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%琼脂糖凝胶电泳，然后采用胶回收试剂盒回收目的条带以纯化产物；最后使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample PreParation Kit建库试剂盒进行文库构建，经Qubit、Q-PCR定量检测构建文库合格后使用NovaSeq6000进行上机测序。

通过对测序序列（Reads）进行拼接、质控和过滤，以97%的一致将序列聚类成为基于序列间相似度的分类操作单元（operational taxonomic units，OTU），然后参照Silva138数据库对得到的OTU序列进行物种注释，并根据物种注释情况进一步分析Alpha多样、Beta多样、物种丰度。

Alpha多样分析包括：（1）稀释曲线：是描述样本多样的曲线，能够直接反映样本相关测序数据量的合理，并间接反映样本中物种的丰富程度。（2）Shannon指数：为菌群物种Alpha多样分析常用的指数，反映不同样本间物种多样和均一的差别，Shannon指数越大说明菌群多样越高。

Beta多样分析：是对两组样品间的菌群构成情况进行比较分析。主坐标分析（PCoA）是常用的Beta多样分析方法，其基于Unweighted Unifrac距离来进行分析，样本间距离越远代表样本间多样差异越大。

物种丰度分析采用T-test检验和LEfSe分析，其中LEfSe分析是一种软件分析，其能够找到组间有统计学差异的生物标志物。

1.5　食管组织苏木素-伊红（HE）染色

完成粪便收集后处两组小鼠，剥取其食管组织并采用4%多聚甲醛溶液固定，之后进行石蜡包埋、切片、HE染色，观察两组小鼠食管组织病理改变。

1.6　统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，先进行方差齐分析，之后进行T-test检验。Anosim相似分析用于检验组间差异是否大于组内，判断实验分组是否存在意义。基于两两样本间的距离值排序获得的秩（组间的为Between，组内的为Within），这样任一两两样本的比较可以获得3个分类的数据，并进行箱线图的展示（若两个箱的凹槽互不重叠，则表明两样本的中位数有显著差异）。以P0.05为差异有统计学意义。

2　结果2.1　食管组织病理改变

两组小鼠在实验过程中未出现亡，MX组小鼠均造模成功。DZ组小鼠食管组织正常，MX组小鼠食管组织可见鳞状上皮增殖、癌巢形成且癌巢内可见角化珠（图1）。

Figure 1

Figure 1 HE staining results of esophagus tissues two groups of mice

2.2　肠道菌群测序数据质量评估与OTU分析

对两组小鼠共20例粪便标本进行16Sr DNA基因测序，对检测的原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据，平均每样品测得86 110条tags，经过质控平均得到83 261条有效数据，质控有效数据量达54 489，质控有效率达63.16%。然后基于有效数据进行分析共得到2 314个OTU，再用OTU序列进行物种注释。结果共有862个OTU注释到物种属水平。

基于OTU的Venn图中，2种不同颜色的圆对应两组小鼠粪便所含的菌群，重叠部分则为两组共同含有的菌群，DZ组较MX组肠道菌群物种丰富程度明显增加，两组小鼠的肠道菌群结构存在差异，见图2。同时选择DZ组与MX组在门水平上丰度排名前10的物种，绘制物种相对丰度柱状图（图3），由图可见，在门水平上两组小鼠样本部分物种丰度存在明显差异，MX组与DZ组相比，拟杆菌门（Bacteroidota）及厚壁菌门（Firmicutes）比例升高，而疣微菌门（Verrucomicrobiota）及变形菌门（Proteobacteria）比例降低。

Figure 2

Figure 2 Venn diagram of intestinal flora between two groups of mice

Figure 3

Figure 3 Relative abundance of species at phylum level intestinal flora of mice between two groups

2.3　两组小鼠肠道菌群Alpha多样分析2.3.1　两组小鼠肠道菌群物种多样曲线

两组小鼠菌群稀释曲线均趋于平坦，则说明目前样本测序数据量渐进合理，即使增加数据量也只会产生少量新的物种，见图4。

Figure 4

Figure 4 Rarefaction curve of intestinal flora between two groups of mice

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